Novinky
Nad Safinou III/365, Vestec
252 42 Jesenice u Prahy
tel. +420 244 914 651
apronex@apronex.cz
Produkce rekombinantních proteinů
Na základě zadání zákazníka nabízíme kompletní servis pro vývoj stabilní produkce rekombinantních proteinů. Služba zahrnuje přípravu expresních plazmidů pro prokaryotní nebo eukaryotní expresi s použitím dodaného DNA templátu nebo templátu z naší databáze. Kódující sekvence je optimalizována pro maximální kvalitativní a kvantitativní produkci proteinu v daném expresním systému systému. Pro expresi je vybrán klon s nejvyšší produkcí. Rekombinantní proteiny jsou dodávány buď s afinitním tagem (His-Tag) nebo prostý jakéhokoli tagu.
-
Kultivace
-
Prokaryotická kultivace
Kultivace v buňkách E. coli zahrnuje transformaci expresního vektoru s požadovaným genem do vhodných kompetentních buněk, přípravu inokula a kultivaci buněk v malém objemu (do 5,5 l media) nebo po dohodě ve velkém objemu ve fermentoru (do 1000l media). V procesu exprese proteinu jsou vzorky biomasy sbírány ve 3 bodech fáze růstu. Všechny odebírané vzorky jsou po kultivaci biomasy analyzovány pomocí SDS-PAGE a nebo Western blot.
-
Eukaryotická exprese
Eukaryotická kultivace v savčích buňkách transientních linií zahrnuje transfekci Vámi dodaného nebo námi vyvinutého expresního vektoru do hostitelských buněk, kultivaci (v malých objemech do 5 ml media nebo ve velkých objemech do 0,5 l media) a následné monitorování exprese proteinu.
Eukaryotická kultivace v kvasinkových buňkách Pichia pastoris spočívá v transformaci expresního vektoru do kompetentních buněk, kultivaci a monitorování exprese proteinu pomocí SDS-PAGE, Western blotu nebo dot-blotu.
- Purifikace
-
Proteiny jsou purifikovány standardní chromatografickými postupy do vysoké koncentrace a čistoty. Chromatografické metody purifikace běžně používané v našich laboratořích jsou:
-
gelová filtrace
-
iontově-výměnná chromatografie
-
purifikace využívající afinitu k purifikačním značkám
-
purifikace pomocí imunosorbentů nebo sorbentů s hydrofobní interakcí.
-
-
Všechny purifikační kroky jsou průběžně monitorovány pomocí absorbance při 280 nm. Jednotlivé frakce purifikačního procesu jsou obvykle analyzovány metodami SDS-PAGE, v případě potřeby mohou být použity jiné testy.
-
Proteinový refolding
Jevem, provázejícím expresi proteinů, bývá tvorba nerozpustných útvarů tzv. inkluzních tělísek v bakteriální cytoplasmě. K produkci rekombinantního proteinu do inkluzních tělísek může docházet z mnoha různých důvodů (toxicita rekombinantního proteinu pro bakteriální metabolismus, nepřítomnost vhodného chaperonu atd.), přičemž zastoupení rekombinantního proteinu bývá v inkluzních tělíscích velice významné. Výhodou tvorby proteinu ve formě inkluzních tělísek je, že jsou tělíska snadno oddělitelná od bakteriálního cytosolu. Inkluzní tělíska se obvykle rozpouštějí vysokými koncentracemi močoviny nebo guanidinium chloridu.
Naše laboratoř testuje různé podmínky re-foldingu, např.:
-
Dialýza (postupné snižování koncentrace močoviny v roztoku)
-
Ředění
-
Neionogenní detergenty
-
Lipidy
-
Glycerol, sacharóza
-
EDTA
-
In vivo folding – enzymy (disulfid isomerase, chaperony)
- Odstranění endotoxinů (LPS)
Běžné purifikační metody proteinů (např. ultrafiltrace, iontovýměnná chromatografie apod.) nejsou pro odstranění endotoxinů obvykle dostatečné. Naše laboratoř nabízí službu účinného odstranění endotoxinů (LPS) z roztoku i v případě jejich přítomnosti v nízké koncentraci.
Lze odstranit endotoxiny z vodných roztoků obsahující nízkomolekulární nebo vysokomolekulární látky (proteiny, peptidy, protilátky nebo plasmidovou DNA).
Dodací podmínky (Produkce rekombinantního proteinu)
Cena a dodací podmínky závisí na zvoleném expresním systému a typu rekombinantního proteinu.