Novinky
Nad Safinou III/365, Vestec
252 42 Jesenice u Prahy
tel. +420 244 914 651
apronex@apronex.cz
-
Příprava buněčného extraktu
Buňky jsou rozrušeny sonikací nebo pomocí detergentu a následně jsou centrifugovány. Supernatant a sediment, tj. rozpustné a nerozpustné proteinové frakce jsou odděleny a analyzovány na přítomnost proteinu.
-
Izolace inkluzních tělísek z E.coli a extrakce proteinů z nerozpustných frakcí
V případě, že je požadovaný rekombinantní protein je sekretován v nerozpustné formě, musí být protein získán rozpuštěním inkluzních tělísek. Bakteriální sediment je promyt a inkluzní tělíska jsou extrahovány močovinou, guanidium chloridem nebo detergenty. Extrakční alternativy se mohou lišit s ohledem na cílový protein.
-
Chromatografie
Proteiny jsou purifikovány standardní chromatografickými postupy do vysoké koncentrace a čistoty. Chromatografické metody purifikace běžně používané v našich laboratořích jsou:
-
gelová filtrace
-
iontově-výměnná chromatografie
-
purifikace využívající afinitu k purifikačním značkám
-
purifikace pomocí imunosorbentů nebo sorbentů s hydrofobní interakcí
Všechny purifikační kroky jsou průběžně monitorovány pomocí absorbance při 280 nm. Jednotlivé frakce purifikačního procesu jsou obvykle analyzovány metodami SDS-PAGE, v případě potřeby mohou být použity jiné testy.
-
-
Proteinová renaturace (re-folding)
Jevem, provázejícím expresi proteinů, bývá tvorba nerozpustných útvarů tzv. inkluzních tělísek v bakteriální cytoplasmě. K produkci rekombinantního proteinu do inkluzních tělísek může docházet z mnoha různých důvodů (toxicita rekombinantního proteinu pro bakteriální metabolismus, nepřítomnost vhodného chaperonu atd.), přičemž zastoupení rekombinantního proteinu bývá v inkluzních tělíscích velice významné. Výhodou tvorby proteinu ve formě inkluzních tělísek je, že jsou tělíska snadno oddělitelná od bakteriálního cytosolu. Inkluzní tělíska se obvykle rozpouštějí vysokými koncentracemi močoviny nebo guanidinium chloridu.Naše laboratoř testuje různé podmínky re-foldingu, např.:
• Dialýza (postupné snižování koncentrace močoviny v roztoku).
• Ředění.
• Neionogenní detergenty.
• Lipidy.
• Glycerol, sacharóza.
• EDTA.
• In vivo folding – enzymy (disulfid isomerase, chaperony).
-
Odstranění endotoxinu
Naše laboratoř nabízí službu účinného odstranění endotoxinů (LPS) z roztoku i v případě jejich přítomnosti v nízké koncentraci. Běžné purifikační metody proteinů (např. ultrafiltrace, iontovýměnná chromatografie apod.) nejsou pro odstranění endotoxinů obvykle dostatečné.
Lze odstranit endotoxiny z vodných roztoků obsahující nízkomolekulární nebo vysokomolekulární látky (proteiny, peptidy, protilátky nebo plasmidovou DNA).
DODACÍ PODMÍNKY:Dodací podmínky závisí na typu purifikovaného proteinu. Po počáteční konzultaci je zákazník průběžně informován o výsledcích purifikace. Purifikační protokol spolu se vzorkem purifikovaného proteinu bude zákazníkovi zaslán k otestování.